RT-qPCR是一个非常注重细节的实验。跑q的体系很小，任何细节问题都可能带来不小的误差。今天师兄和大家分享下qPCR实验经验
1⃣计算反应体系并准备物品
跑q的体系里有很多成分，体积也小，如果用移液器一个一个加又不准又麻烦。我一般习惯把SYBR和cDNA混合，引物和水混合，使用10μL体系，这样SYBR+cDNA混合物每孔加6μL，引物+水混合物每孔加4μL。计算时需要多算10%，作为损耗的余量。
从冰箱里拿出SYBR、引物、样品等试剂，解冻后先离心，再使用。
摆好ep管，写好标记，和样品及引物对应着放，养成好习惯。
全程戴好口罩和手套，避光操作，冰上操作，使用无RNA酶耗材和DEPC水。
2⃣配置体系和加样：细节决定成败
SYBR有点粘稠，会沾在吸头的内壁或外壁上，造成误差。我一般用反向移液法加SYBR，即吸的时候按到第二档，吸取更多的液体，加的时候按到第一档，加完吸头里还会。反向移液法可以保证打出的液体是需要的体积，避免粘稠液体粘在吸头内壁又吹不出来造成的误差。
此外，在加样的时候要注意仅仅用吸头的顶端接触孔壁，不要让吸头外壁碰到孔壁，避免吸头外壁沾到的液体蹭到孔里。
加第二种混合液时，可以反手或者直接把板转180°，加在孔的另一侧。不碰到另一种液体，就不用一孔一换枪头，大大简化步骤，提高效率。
3⃣封板，离心，上机
加完样品封板时，把撕下来的白色塑料纸留着，垫在膜上。我喜欢用跑WB用的刮板反复刮，据说用贴手机膜的工具会更好用。封板膜本身没有粘性，是压力让它能够贴在板上，所以要注意刮到板的每一个角角落落，让每一个孔都被贴严实。
封板后离心2分钟，上机检测。
师兄最开始跑q的时候加一块板要至少一个小时，96孔板看着就头晕，加样的时候简直不敢跟别人说话，而跑出来的结果还经常组内差距很大，数据没法用。后来做得多了就逐渐掌握了一些关键细节和技巧，越来越得心应手。开始跑384孔板以后，看着96孔板都觉得亲切可爱了起来。做实验，尤其是这种精细操作的实验，多做多练就会有进步。
1⃣计算反应体系并准备物品
跑q的体系里有很多成分，体积也小，如果用移液器一个一个加又不准又麻烦。我一般习惯把SYBR和cDNA混合，引物和水混合，使用10μL体系，这样SYBR+cDNA混合物每孔加6μL，引物+水混合物每孔加4μL。计算时需要多算10%，作为损耗的余量。
从冰箱里拿出SYBR、引物、样品等试剂，解冻后先离心，再使用。
摆好ep管，写好标记，和样品及引物对应着放，养成好习惯。
全程戴好口罩和手套，避光操作，冰上操作，使用无RNA酶耗材和DEPC水。
2⃣配置体系和加样：细节决定成败
SYBR有点粘稠，会沾在吸头的内壁或外壁上，造成误差。我一般用反向移液法加SYBR，即吸的时候按到第二档，吸取更多的液体，加的时候按到第一档，加完吸头里还会。反向移液法可以保证打出的液体是需要的体积，避免粘稠液体粘在吸头内壁又吹不出来造成的误差。
此外，在加样的时候要注意仅仅用吸头的顶端接触孔壁，不要让吸头外壁碰到孔壁，避免吸头外壁沾到的液体蹭到孔里。
加第二种混合液时，可以反手或者直接把板转180°，加在孔的另一侧。不碰到另一种液体，就不用一孔一换枪头，大大简化步骤，提高效率。
3⃣封板，离心，上机
加完样品封板时，把撕下来的白色塑料纸留着，垫在膜上。我喜欢用跑WB用的刮板反复刮，据说用贴手机膜的工具会更好用。封板膜本身没有粘性，是压力让它能够贴在板上，所以要注意刮到板的每一个角角落落，让每一个孔都被贴严实。
封板后离心2分钟，上机检测。
师兄最开始跑q的时候加一块板要至少一个小时，96孔板看着就头晕，加样的时候简直不敢跟别人说话，而跑出来的结果还经常组内差距很大，数据没法用。后来做得多了就逐渐掌握了一些关键细节和技巧，越来越得心应手。开始跑384孔板以后，看着96孔板都觉得亲切可爱了起来。做实验，尤其是这种精细操作的实验，多做多练就会有进步。
