造模方法#实验外包##动物造模##细胞实验##蛋白实验##病理检测#
1、实验动物
Wistar大鼠，3～4月龄，体重150～200g
2、实验方法
1、制作肝性脑病模型：给予40% CCl4、橄榄油混合溶液腹部皮下注射，（CCl4∶橄榄油=1∶2.5），5%乙醇自来水溶液自饮。首次给药每只鼠0.5mL/100g，以后每只0.3mL/100g，每周注射2次，共9周。一般情况下，此时造模成功。在造模过程中记录动物体重、外观指标、死亡率和死亡数，同时观察行为活动状态，特别是神经系统的功能状态，死亡动物做完记录后予以剔除。
2、步骤：实验开始前所有动物均进行Morris水迷宫测试，建立水迷宫逃避潜伏期之后按完全随机的方法抽取大鼠作为正常对照组，剩余大鼠进入造模组，造模组大鼠按复合因素造成肝硬化的方法进行实验，实验第九周（肝硬化晚期）将造模组和对照组大鼠进行水迷宫测试和脑电图（EEG）测试，记录逃避潜伏期，并观察脑电图（EEG）有无肝性脑病的典型高幅慢波。HE的纳入标准：（1）模型组大鼠Morris水迷宫测试值大于对照组x+2.5s；（2）EEG测试有典型肝性脑病高幅慢波者；（3）出现典型HE行为、情绪者。HE模型建立。
3、Morris 水迷宫测试方法：将水注入直径130cm、高50cm的圆形不透明水箱中，水深25cm、水温（26±1）℃。水中加适量奶粉使水保持不透明状态。测试前1d将大鼠放入水箱中进行适应性训练。测试时，将大鼠面朝池壁置于水箱中以测量其发现水下1.5cm 处平台（8cm × 8cm） 的能力。连续测试5d，每天训练两组次，9：00和17：00时各一组次，每一组次训练8次。观察指标为发现并爬上平台时间（逃避潜伏期），取每一组次的平均值进行比较。如果大鼠在120s内没有发现平台，则将大鼠置于平台上，60s后拿离迷宫，其搜索平台的时间记为120s。
4、脑电图的测试方法：大鼠在1%戊巴比妥钠（45mg/kg体重）腹腔麻醉下，俯卧固定，安置额枕骨间电极，鼻根部及双耳分别接地线，用16导脑电图机测定，并用电脑描记脑电图，时间常数0.3，高频滤波100Hz。固定、调试好仪器，安装电极，单极导联描记，于安静状态下进行描记，记录脑电图，连续观察10min，观察振幅与频率。振幅为波顶到波底间的垂直高度，代表脑部电位活动的大小；频率为同一周期的脑电波在1s内重复出现的次数。
5、血液生化检测：全部大鼠在灌注前，水合氯醛麻醉后剪开胸腔，用一次性注射器无菌心脏穿刺采血5mL。其中取1mL置于无热原肝素管中迅速用全自动血氨分析仪测血氨（BA）; 取2mL全血，分离血浆后以全自动生化分析仪测定丙氨酸转氨酶（ALT）、总胆红素（TBil）、尿素氮（BUN）。
6、病理检查：取大鼠肝脏同一叶肝组织，以4%中性甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，HE染色后光镜观察。
7、检测指标：水迷宫逃避潜伏期；EEG；生化指标；切片；动物活动情绪行为观察。